转录辅助因子GRIP1差异影响髓样细胞驱动的神经炎症和对IFN-β治疗的反应

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多发性硬化症（MS）是一种会影响中枢神经系统（CNS）的慢性炎症性疾病，其病因仍未知（Bishop和Rumrill，2015；Dendrou等，2015；Lassmann，2011）。在临床上，已经描述了四种类型的MS：原发性进行性MS；原发性MS。继发性进行性MS 逐步复发；最常见的复发缓解型MS（RRMS；Milo和Miller，2014年）。对于所有类型的疾病，自身免疫脱髓鞘作用都是该疾病的标志，这促使人们开展许多工作来剖析T细胞的作用（Jäger等人，2009年; Kaskow和Baecher-Allan，2018年; Liu等人，2008年; McGinley等人。 ，2018 ;Merrill等，1992）和B细胞（Negron等，2019 ; Staun-Ram和Miller，2017 ; Weber等，2010）。然而，最近的证据表明，小胶质细胞（MG）等髓样细胞在MS发病机理中起着关键作用（Croxford等人，2015 ; Mahad和Ransohoff，2003 ; Mishra和Yong，2016 ; Sominsky等人，2018 ; Yamasaki， 2014年）。MG是驻留在CNS中的特殊巨噬细胞（MФ）样细胞，具有分叉的形态和运动过程，使MG可以在整个CNS中迁移，不断地调查环境，并在检测到任何变化时做出相应的响应。在健康条件下，它们可通过修剪神经元，清除碎屑并在发育和成年生活中提供神经营养因子来确保大脑稳态（Hagemeyer等人，2017年; Kierdorf和Prinz，2017年）。MG和MФ共有一个共同的红血球样祖细胞，但它们在发育的早期（胚胎第9.5天[E9.5]）就分开了，这时MG迁移到了胎儿的大脑中，在那里它们通过自我更新来维持自身的池（Ginhoux等人。 ，2010 ; Kierdorf等，2013）。相比之下，MФ依赖于骨髓（BM）衍生的前体进行更新，并能够像单核细胞一样循环进入血液或驻留在组织中，这取决于它们的作用和免疫状态（Goldmann等，2016）。两种细胞类型均显示出高可塑性（Holtman等人，2017 ; Italiani和Boraschi，2014 ; Murray，2017 ; Shemer等人，2015），并且可能具有相似的作用，尤其是在炎症过程中。在MS等疾病中，MG与CNS浸润的MФ一起通过抗原呈递，髓磷脂的吞噬作用和细胞因子分泌来塑造免疫反应（Almolda等，2011 ; Fourgeaud等，2016 ;Franco和Fernández-Suárez，2015年）。这些功能使MG和MФ成为神经炎症的主要效应器，但是它们对MS发病机理的特定且可能不同的贡献仍然不清楚。

最近的基因组学和转录组学工具可以通过构建“ microgliome ”更好地表征中枢神经系统，尤其是MG的髓样细胞（Gosselin等，2017；Holtman等，2017；Sousa等，2017）。 。越来越多的研究正在研究稳态和MS或实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）期间MG和MФ的转录特征，这是RRMS的常用小鼠模型（Holtman等人，2017 ; Sevastou等人，2016 ; van der Poel等，2019）。这些研究表明，除了这两种细胞类型共有的表面蛋白（例如Cd45，Cd11b）外，某些标记是MG特异的（Tmem119 / Sall1）或MФ特异的（Ccr2），不仅说明了这些细胞的独特本体，而且说明了根据当地环境的不同，他们的反应也不同（Bennett等人，2016 ; Buttgereit等人，2016 ; Gu等人，2016 ; Koeniger和Kuerten，2017）。然而，在神经炎症过程中，MФ与大量免疫细胞一起渗入CNS，并与MG一起被激活，从而改变了转录组组成，并因此改变了其表面表达的分子组成，使这些细胞难以区分。其他（Greter等，2015；Prinz等人，2011年）。

MS无法治愈；然而，糖皮质激素（GC）激素和I型干扰素（特别是IFN-β）可用于缓解MS症状（Goodin ，2014；Vosoughi和Freedman，2010；Wingerchuk和Carter，2014）。GC激素是有效的抗炎药，对于预防MS发作期间不可逆的神经元损伤也很重要（Goodin，2014；Smets等，2017）。它们通过GC受体（GR）起作用，GC受体是依赖配体的转录因子，定位于特定的基因组结合位点并激活抗炎基因（例如Dusp1，Tsc22d3），或者通过与非受体转录因子AP1和NF-κB束缚，抑制促炎性因子（例如Tnf，Il1b ; Nissen和Yamamoto，2000 ; Sacta等人，2018 ; Uhlenhaut等人，2013）。有趣的是，独特的p160 / NCoA GR核心调节剂-GR相互作用蛋白1（GRIP1 / NCoA2 / TIF2）-促进GR介导的激活和抑制（Chinenov等，2012 ; Lee等，2002 ; Rollins等。 ，2017）。实际上，髓样细胞（如MФ）中GRIP1的缺失会导致多种炎症介质的急剧抑制，这在体内会使小鼠对急性LPS引起的败血症和慢性高脂饮食引起的代谢性炎症敏感（Chinenov等，2012）。 ; Coppo等人，2016 ; Rollins等人，2017）。

规定RRMS患者使用IFN-β可以延缓复发和疾病进展（Bermel和Rudick，2007年）。TLR3激活会触发I型IFN途径，而TLR3激活则通过一系列衔接子蛋白导致IFN调节因子3/7（IRF3 / 7）的磷酸化，该因子与IFN刺激的应答元件结合并启动IFN-β基因。转录。新产生的IFN-β通过细胞表面的IFN-α/β受体（IFNAR）以旁分泌和自分泌的方式起作用，通过JAK / STAT磷酸化和ISGF3（STAT1 / STAT2 / IRF9）转录复合物，可结合IFN刺激的应答元件并激活众多IFN刺激的基因（ISG; Chen等，2017）。小鼠研究表明，IFN-β的全身KO使EAE恶化（Teige等人，2003年），骨髓细胞中的条件IFNAR-KO或造血细胞中的GR-KO也导致更严重的疾病和更大的致死率，为IFN-β在EAE和MS中的治疗功效提供了遗传支持（Prinz等，2008；Wüst等，2008）。然而，鉴于I型IFN在其他自身免疫性疾病（例如系统性红斑狼疮，Sjögren综合征和视神经脊髓炎）中已确立的致病性作用，IFN-β在MS中的保护作用令人困惑。Axtell等人，2011；乌鸦，2014）。干扰素-β在MS中有益功能的确切机制仍不清楚。出乎意料的是，我们发现GRIP1与IRF家族的几个成员发生物理相互作用，并与IRF 3、7和9协同增强了MФ中的I型IFN信号（Flammer等，2010；Reily等，2006）。从未评估过GRIP1对体内I型IFN网络的贡献。

鉴于MФGRIP1与GRs和IRFs（据报道介导MS中的神经保护作用的转录因子）都协同作用，我们试图评估该调节因子在神经炎症过程中的功能。在这里，我们使用在骨髓细胞中条件性缺乏GRIP1的小鼠，我们描述了GRIP1对EAE的神经炎症期有意想不到的影响，可能指出了它在MG与外周MФ中所起的不同作用。我们分析在稳态和中性粒细胞和单细胞水平的EAE期间中枢神经系统的髓室发生的转录组变化。最后，我们提出了GRIP1数据，该数据驱动了EAE小鼠中MS的一线治疗的效果。

由于MG在MS和EAE中都起着核心作用，因此我们首先建立了一个细胞培养系统来研究和离体处理这些细胞。我们从P0新生小鼠中分离了原代MG，并在星形胶质细胞单层上扩展了MG的混合胶质细胞培养物（请参见材料和方法）。然后在CD11b包被的磁珠上纯化MG，并在不存在或存在地塞米松（Dex；合成GC）或IFN-β（临床上用于减轻MS中神经炎症的两种化合物）的情况下，用促炎性LPS处理2小时。使用RNA测序（RNAseq）进行表达谱分析。在963个LPS调控的基因中，有553个被诱导。其中有163个被Dex下调，有115个被IFN-β下调（图S1 A， 最佳）。有趣的是，两个数据集中只有20个基因的一小部分重叠。也就是说，它们被Dex和IFN-β所抑制，但是其中编码关键促炎细胞因子Tnf，Illa，Il1b和Il12b的那些都在其中（图S1A，右上方，带下划线）。我们以前曾证实GRIP1通过增强的抗炎基因（例如，无论是活化介导BM来源的原MФ（BMMФ）GR的抗炎作用Tsc22d3，DUSP1）和促炎的如压制TNF，IL1A，和Il1b（Rollins等，2017）。为了检查GRIP1丢失对MG的影响，我们对来源于髓系中缺少GRIP1的LysMCre + / + ; GRIP1 fl / fl小鼠品系（称为GRIP1-cKO）的培养物中衍生的P0 MG进行了RNAseq分析（图1 A和图S1 B）。从1,403个LPS反应基因中，诱导了854个，而其中约一半（430）被Dex抑制了。然而，只有96个被IFN-β下调（图S1A，底部）。结果，GRIP1-cKO MG中被Dex和IFN-β抑制的基因数量降至11个，不再包含Tnf和Il12b（图S1A，右下方，带下划线）。

对GRIP1缺失对GR抑制促炎基因的影响的定量评估表明，MG中GRIP1的丢失适度减弱了Nlrp3的抑制（图S1 B）。另外，典型的ISG Ifit1在GRIP1-cKO MG中的IFN-β反应性比WT小（图S1 B）。总体而言，GRIP1缺失对这两类代表基因的离体影响与MФ中所见相似。值得注意的是，I干扰素对LPS诱导的基因的影响以及GRIP1在这种情况下的潜在作用尚未在任何细胞类型中进行过评估。

鉴于广泛的证据表明MG的转录组成是由当地的CNS环境决定的（Gosselin et al。，2017），我们认为评估3周分化和扩增后的MG反应可能低估了GRIP1缺失对治疗的影响。 ，或同时在MG生物学上同时使用。因此，为了评估GRIP1在体内MG中的作用，我们在WT和GRIP1-cKO小鼠中诱导了EAE，并监测了疾病进展（请参见材料和方法）。与内毒素休克模型形成鲜明对比的是，GRIP1-cKO小鼠的EAE得分显着低于WT，这与体重减轻较少，存活率更高，两组的症状发作时间或发病率无明显差异有关（图1 B）。）。值得注意的是，WT和GRIP1-cKO小鼠在EAE严重程度方面没有性别特异性差异。也就是说，雄性和雌性GRIP1-cKO小鼠受到类似的保护（图1 B）。重要的是，无论是否使用表达LysM（LysMCre + / + ; GRIP wt / wt）或不表达LysM（LysMCre -/- ; GRIP1 fl / fl）的菌株，GRIP1-cKO的EAE耐药表型都是明显的。作为WT控制（图S2A）。在内毒素休克模型中进一步偏离了GRIP1-cKO的“细胞因子风暴”表型（Chinenov等，2012；Rollins等，2017）），与WT小鼠相比，GRIP1-cKO血清中EAE期间标志性T辅助1型细胞（Th1）细胞因子TNF，IFN-γ和IL-6的水平降低，这与它们较轻的全身炎症反应相对应（图1C），稳态时的基因型之间没有差异（图S2B，左）。

MS和EAE的组织学标志是白细胞浸润，白质损伤和CNS脱髓鞘（Gibson-Corley等，2016 ; Pyka-Fosciak等，2018）。我们在稳态下（图S2 B，右）和EAE期间（图2），从WT和GRIP1-cKO小鼠的颈，腰和胸脊髓节段评估了这些参数。H＆E染色显示GRIP1-cKO的中枢神经系统相对于WT的白细胞浸润显着减弱，这与浸润的T淋巴细胞数量减少相关（图2，A和B）；髓鞘的Luxol固蓝（LFB）染色显示了野生型中枢神经系统的局部脱髓鞘区域（图2，A和B）。MG的功能状态可以通过形态学来定义。在体内平衡时，MG分支并显示高度分支的过程，而在炎症过程中，由于细胞器的积累和代谢活性的增加，活化的MG会撤回其过程并扩大细胞体（Sominsky等人，2018）。图2，A和B展示了位于WT和GRIP1-cKO脊髓实质中的Iba-1阳性MG，与GRIP1-cKO中的分支，多处理的MG相比，WT中具有明显的变形虫样MG。在稳态时，未观察到WT和GRIP1-cKO脊髓之间的组织学差异（图S2 B，右）。

鉴于EAE是由CNS驻留和CNS浸润的外周免疫细胞驱动的，我们通过流式细胞术在稳态下对WT和GRIP1-cKO小鼠脊髓中的免疫细胞群进行了分析（图S2 B，中）。 EAE诱导（图2 C）。使用常见的谱系特异性表面标记对免疫细胞进行分选（参见图S2 C中的门控策略；Greter等人，2015）。如先前所述（Rangaraju等人，2018 ; Sedgwick等人，1991），我们根据CD45的表达水平（MG，CD45低;MФ，CD45高;图S2 C）将MG与MФ区分开来。）。与临床评分和组织病理学一致，尽管在稳态时WT和GRIP1-cKO在稳态时WT和GRIP1-cKO之间的中枢神经系统驻留免疫细胞数量没有差异（图S2 B，中），在EAE期间，GRIP1-cKO积累的总白细胞较少（CD45 +），CNS中的T淋巴细胞（CD3 +），骨髓和B细胞（CD11b +）的数量和初始种群所占的百分比均比野生型小鼠高。重要的是，在GRIP1-cKO小鼠的中枢神经系统中，渗透性MФ的数量显着降低，导致F4 / 80 + CD11 +细胞中“较少稀释的”驻留MG的比例明显较高（图2 C）。总之，这些结果表明，与它在MФ驱动的其他炎症模型中的抑制作用相反，髓样细胞GRIP1在EAE的发作和/或进展中起了允许的作用。

To determine the hallmarks of EAE pathogenesis that were sensitive to GRIP1 deletion, we evaluated the expression of inflammatory mediators in the CNS of control and EAE WT and GRIP1-cKO mice. Although no genotypic differences were observed in the level of any transcripts measured at homeostasis, there was a significant accumulation of proinflammatory Tnf but not anti-inflammatory Il10 during EAE in the brains and spinal cords of WT mice, and this effect was greatly attenuated in GRIP1-cKO (Fig. 3 A and Fig. S3 A, top). Unexpectedly, several established components of the type I IFN network (Irf1, Irf7, Isg15, and Ifit1) were dramatically upregulated during EAE specifically in the WT CNS (Fig. 3 A and Fig. S3 A). Even though this result was consistent with the requirement for GRIP1 in the IFN pathway, a pronounced IFN signature in mice with more severe pathology argues against type I IFN serving a solely protective role in EAE/MS.

In principle, GRIP1 either can act on the periphery to facilitate an immune response and generation of myelin-reactive autoimmune T cells during the inductive phase or, alternatively, can contribute to myeloid cell–driven neuroinflammation during the effector phase. To assess the potential contribution of GRIP1 to each stage of the disease, first, we harvested peripheral immune organs—the spleens and draining LNs (dLNs)—from WT and GRIP1-cKO mice with or without EAE and evaluated their gross morphology. Although the size of the spleens increased significantly during EAE compared to that at homeostasis, there was no genotypic difference in the size of the spleens, number of splenocytes, or number of CD4+ T cells (Fig. 3 B). In addition, flow cytometry performed on the spleens of WT and GRIP1-cKO mice with EAE revealed similar percentages of leukocytes (CD45+), lymphocytes (CD3+), CD4+ or CD8+ T cells, B220+ B cells, and CD11b+ myeloid cells in the two genotypes (Fig. 3 C).

We next isolated CD4+ T cells from spleens and dLNs of WT and GRIP1-cKO mice at day 7 postimmunization (DPI7) or DPI20, restimulated them with myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) peptide in vitro for 72 h, and analyzed the production of Th1 and Th17 cytokines implicated in MS pathology as well as the EAE model. Of those, we observed slightly reduced levels of IFN-γ produced by CD4+ T cells from GRIP1-cKO mice at DPI7 only, whereas the levels of TNF, MCP1, and IL-17A were identical in the two genotypes at both time points (Fig. 3 D). Interestingly, at DPI7, restimulated CD4+ T cells isolated from WT mice produced more IL-4 and IL-10 than the ones from GRIP1-cKO mice, but these differences were abrogated by DPI20 (Fig. S3 B). This result does not definitively establish the T cell subtype mediating EAE in our model, but it illustrates a transiently attenuated Th2 CD4+ T cell signature in the GRIP1-cKO mice compared to WT mice.

To definitively determine the stage of EAE during which GRIP1 contributes to disease, we used a passive EAE model in which the inductive and effector phases are uncoupled from each other. Following EAE induction in WT female donor mice, CD4+ T cells were collected from their spleens and dLNs at DPI10, Th1 polarized in vitro (see Materials and methods), and injected into recipient WT and GRIP1-cKO mice along with pertussis toxin (PTX). Despite expected lower clinical scores in this passive model, WT mice still developed more severe disease, which, strikingly, occurred earlier and in a greater number of animals than it did in the GRIP1-cKO mice (Fig. 4 A). Consistently, GRIP1-cKO mice lost less weight and displayed less immune cell infiltration of the CNS (Fig. 4, A and B). Together, these results demonstrate that myeloid cell GRIP1 facilitates the effector neuroinflammatory phase of EAE.

GRIP1 is a broadly acting transcriptional coregulator whose role in MS/EAE or in MG at any state has never been investigated. To begin to identify the GRIP1-dependent transcriptome changes leading to neuroinflammation, we performed bulk RNAseq analysis on CD45+Cd11b+ myeloid cells isolated from spinal cords of WT and GRIP1-cKO mice. Consistent with a lack of overt phenotype in our conditional GRIP1-deficient mice (Coppo et al., 2016; Rollins et al., 2017), at homeostasis, a CD45+Cd11b+ CNS myeloid cell population composed principally of MG displayed no significant transcriptomic differences between WT and GRIP1-cKO mice (Fig. 5 A, upper panel; GRIP1 deletion efficiency is shown on the right as no